Die werkingsmeganisme is inhibisie van proteïensintese deur binding aan die 30S ribosomale subeenheid van mikroörganismes wat vatbaar is vir
oksitetrasiklien, daardeur
wat die verbinding tussen ribosome en aminoasiel-tRNA voorkom. Daar word ook geglo dat oksitetrasiklien omgekeerd met 50S-ribosome verbind en die deurlaatbaarheid van die sitoplasmiese membraan van die sensitiewe mikroörganismes verander. Oksitetrasiklien, teen hoë konsentrasies, kan ook proteïensintese in selle inhibeer.